lunes, 25 de enero de 2010

Laboratorio Oxidación de Azúcares

La energía en los seres vivos

En los ecosistemas la energía necesaria para la vida proviene principalmente del Sol. Por medio de la fotosíntesis los productores fijan la energía luminosa y la transforman en energía química, que se acumula en una sustancia llamada glucosa.

Este es el "combustible" que los seres vivos utilizan para liberar la energía mediante la respiración; la glucosa se degrada hasta convertirse en dióxido decarbono ( CO2 ), agua ( H2O ) y energía

Metabolismo

Se conoce con este nombre a las reacciones químicas que ocurren en la célula, y que la mantienen realizando sus funciones vitales, las cuales pueden ser de tres tipos:




  • Reacciones en las cuales se forman sustancias nuevas, con consumo de energía.




  • Procesos para conservar sustancias.





  • Reacciones en las cuales se degradan sustancias y se libera energía.



De esta forma se puede observar que existen tres tipos de reacciones metabólicas:


  1. Catabolismo: Reacciones químicas que implican la ruptura de moléculas grandes ( macromoléculas ), en moléculas más pequeñas, cuya finalidad es liberar energía química. Entre ellas están las reacciones de digestión o hidrólisis de carbohidratos, lípidos y proteínas.







  1. Anabolismo: Reacciones químicas que implican la síntesis de moléculas grandes, a partir de moléculas pequeñas. Este tipo de reacciones llamadas de biosíntesis, utilizan la energía producida en el catabolismo en forma de ATP. Entre estas reacciones se encuentran la fotosíntesis, la síntesis de ADN y la síntesis de proteínas por ejemplo.







  1. Anfibolismo: Son aquellas reacciones metabólicas que pueden ser catabólicas o anabólicas, por ejemplo el Ciclo de Krebs.




Todos los seres vivos necesitan energía para su funcionamiento, por lo cual la naturaleza ha ideado una manera de almacenar la energía, para ser utilizada cuando sea requerida; y es por medio de sustancias químicas llamadas moléculas ricoenergéticas, como por ejemplo el ATP. La energía se obtiene de moléculas que sufren reacciones químicas y se almacena en estas moléculas ricoenergéticas.







Catabolismo de la Glucosa


Es la oxidación de azúcares, lo cual produce energía que luego es aprovechada por la célula. La glucosa se degrada con el fin de liberar energía ( proceso catabólico u oxidativo ). La respiración celular es un proceso aeróbico y en algunos libros se suele clasificar a la fermentación como respiración anaeróbica, lo cual es un error. La respiración es aeróbica y la fermentación es anaeróbica pero no es un proceso de respiración.





En ambos casos la glucosa se degrada, en ausencia de oxígeno se transforma en dióxido de carbono ( CO2 ) y alcohol CH3CH2OH ( fermentación alcohólica ) o en lactato CH3CHOHCOO- ( fermentación láctica) y produce además 2 moléculas de ATP


Parte 1. Fermentación de diferentes carbohidratos por levaduras.


Materiales:
Por grupo: 3 portaobjetos, 3 cubreobjetos, gotero.
General:    Solución de glucosa 10%, solución de sacarosa 10%, solución de   almidón 10%, levadura comercial.


En general las soluciones azucaradas fermentan cuando organismos microscópicos y heterótrofos como las levaduras, se encuentran en ellas. Usando como indicador el desprendimiento de burbujas de CO2 se puede comprobar que no todos los azúcares pueden servir de sustrato para la levadura.


Fermentación Alcohólica:




La llevan a cabo principalmente las levaduras, al final de este proceso se obtiene etanol, CO2, y ATP. Este proceso se utiliza en la industria de las bebidas alcohólicas ( vino, cerveza ).



Procedimiento:


Antes de realizar las observaciones agregue a cada solución unos cuantos granos de levadura comercial. 





A cada uno de los portaobjetos agregue una gota de cada solución con levadura tratando de depositar células de levadura en el portaobjetos. Cubra cada portaobjetos con cuidado de que no queden burbujas. 




Para cada solución ( almidón, sacarosa, glucosa ).  Deje reposar al menos unos 20 minutos y observe en primera instancia a simple vista sobre un fondo oscuro.




Luego observe cada portaobjetos en mediano y alto poder y dibuje, anote también los resultados.
  • ¿ Cómo es la formación de burbujas en cada uno de los tres portaobjetos ? ¿ Por qué ?
  • ¿ De qué sustancia son las burbujas ? Explique.
  • ¿ Qué fenómeno está ocurriendo ?

Parte 2. Fermentación láctica y efecto de la temperatura


Materiales
Por grupo: 4 tubos de ensayo grandes , gradilla, termómetro, 4 portaobjetos, 
                    4 cubreobjetos

General:    4 matraces de leche natural, 3 mantenidas 24 horas a temperatura de 38C, ambiente y refrigerador y 1 de Yogurt natural, 3 pipetas 10 mL, solución de azul de Bromotimol al 1 %, gotero, azul de metileno



Fermentación Láctica:





Se lleva a cabo en células animales en el tejido muscular fuerte. La glucosa se degrada hasta ácido láctico y ATP, este proceso es el causante del arratonamiento.





La fermentación láctica es un proceso frecuente que llevan a cabo organismos como Lactobacillus y cuyo resultado es el agriamiento de la leche; esto se determina por cambios en el potencial eléctrico que se pueden detectar con un indicador REDOX como el azul de Bromotimol; se verificara también el efecto de la temperatura en ella.


Procedimiento


Agregue a 3 tubos de ensayo 10 mL de leche mantenida en cada una de las temperaturas y a otro 10 mL de Yogurt natural. Incorpore a cada tubo un gotero de azul de Bromotimol 1 %. Observe y anote los resultados.


Resultados:


Anote sus observaciones a continuación:


Cuadro 1. Efecto de la temperatura en la fermentación láctica

Temperatura
de la leche





Color
antes


Color
después


38
C













24 C












10
C















Yogurt












  •     ¿ Por qué se produjo cambio de color en cada caso?. Explique
  •     ¿ En cuál tubo fue el color más intenso y por qué ?
  •     Investigue sobre la importancia biológica de los procesos de fermentación
  •     ¿ Porqué se empleó un indicador redox en este caso ? Explique

Tome una gota de cada uno de los tubos de ensayo u agregue una gota de Azul de Metileno, observe al microscopio compuesto en alto poder o la lente de inmersión en aceite, dibuje lo que observa y trate de identificar los bacilos presentes en la solución






viernes, 15 de enero de 2010

Técnicas de tinción




Materiales:   Diversas muestras de tejido vegetal, microscopio, portaobjetos, cubreobjetos, gotero, lámpara de alcohol, navajillas.




Las estructuras celulares son ( a excepción del cloroplasto ) bastante difíciles de observar a simple vista, esto debido a que aproximadamente el 70 y 90% de la célula es agua. Por esta razón se hace necesario hacerlas visibles, es aquí donde los diferentes tintes que existen son de utilidad.  El tipo de tinte a aplicar depende del tipo de estructura que se deseé observar, pero en general los procesos de aplicación del mismo comprende varias etapas:

1. Fijación del tejido
2. Lavado del fijador
3. Aplicación del tinte

En algunos tejidos ( vegetales y fúngicos ) se hace necesario hidrolizar las paredes celulares. A continuación se explica la preparación de algunos tintes y luego cómo aplicarlos al tejido.

Fijadores 

La función del fijador es matar al tejido provocando el menor daño posible. Algunos de los fijadores más empleados son los siguientes:

Alcohol etílico:   Se consigue puro en concentraciones de 96% m/m, pero este se usa en concentraciones al 70% m/m. Ofrece buenos resultados en la fijación y conservación de organismos enteros o de estructuras anatómicas. En la fijación celular es útil para conservar ciertas enzimas, pero disuelve grasas celulares. El etanol comercial se vende en ocasiones diluido al 70% pero mezclado con tintes, en tales casos antes de emplearlo se debe separar del tinte utilizando carbón activado y agitar, una vez que desaparezca el color se debe filtrar el líquido en algodón. Para efectuar la dilución del 96% al 70% se utiliza en proporción de 3 : 1 en agua destilada.



FAA: ( Formalina, Acido acético, Alcohol ) Es el fijador más empleado y recomendado para los tejidos vegetales y animales, se puede preparar en varias formas, variando la concentración de sus componentes. Debe dejarse actuar por un espacio mínimo de 24 horas.

Formalina comercial ( 36% )              10 mL
Agua destilada                                    35 mL
Acido Acético glacial                          5 mL
Alcohol etílico 96%                             50 mL




Colorantes

Estos se usan para visualizar as diferentes estructuras celulares y subcelulares en ocasiones se pueden combinar para obtener contrastes. Los más empleados son:

Eosina: Se conocen 2 compuestos con este nombre y están  relacionados: la eosina Y (tetrabromofluoresceína ), comúnmente conocida como eosina amarilla, y la eosina B (dibromodinitrofluoresceína ), también conocida como eritrosina B azulada. Ambas, en principio, son intercambiables, sin que sean notables las diferencias entre ellas en el resultado de la tinción, por lo que la preferencia de una sobre otra suele seguir un criterio subjetivo. A pesar de ello, la eosina Y es la mas utilizada en procedimientos rutinarios histológicos, como tinción de contraste el la técnica de la Hematoxilina - Eosina.  La Eosina es un Colorante amarillento – anaranjado usado comúnmente para contrastar con otros, se puede utilizar en solución acuosa al 1% o alcohólica al 5%.


Tinción histológica con Eosina Y

Eosina acuosa 1%


                          Eosina                          1 g
                          Agua destilada              99 mL

Eosina alcohólica 5% 

                          Eosina                          5 g
                          Alcohol etílico 96%      95 mL

Safranina O 

Es un colorante biológico, de contraste que se utiliza en la Tinción de Gram para proporcionar un color violeta más intenso a las bacterias Gram+ y tiñe de rosa a las bacterias G- ; en histología y en citología. La safranina se usa como líquido de contraste en algunos protocolos de tinción, coloreando el núcleo celular de rojo. Este colorante se utiliza especialmente para técnicas histológicas animales y vegetales.


  Diferentes cortes vegetalkes preparados con Safranina O

Preparación: Pese 1 g de Safranina y disuelva en 10 mL de alcohol 50%, agregue 85 mL de agua destilada. En el momento de usar diluya una parte de la solución en 9 partes de agua destilada.

Sudán III o Sudán IV

Usado comúnmente en tejidos vegetales o animales para diferenciar las grasas.  Los colorantes para grasas son más solubles en las propias grasas que en el medio en el que van disueltos. Así, al bañar la grasa con la solución del colorante éste tiende a disolverse en la grasa que se va cargando del colorante. Por regla general estos colorantes siempre van en solución alcohólica o bien en una mezcla de alcohol/acetona o alcohol/agua. El Sudán IV produce una coloración progresiva, es decir, que a más tiempo de exposición al colorante mayor es la intensidad de tinción.


Tincion de una placa en un Ateroma con sudan IV

Preparación

                    Acetona                               50 mL
                    Alcohol etílico 70%              50 mL
                    Sudán III o IV                      0,2 g


Otra forma de preparar el Sudán IV es pesando 1 g de Sudán IV, disuelva en 100 mL de etanol 95%, caliente hasta ebullición. Después agregue 40 mL de glicerina a 60 mL de la solución. Para teñir en cualquiera de los dos casos, corte secciones muy delgadas del material y agregue el colorante deje actuar por 20 minutos y luego caliente suavemente.

Para la fijación previa del tejido el mejor fijador es el formol, que, si bien fija totalmente las grasas neutras, actúa de manera variable sobre le resto de las estructuras lipídicas (colesterol y derivados, fosfolípidos, esfingolípidos...). El formol es aún mejor fijador de grasas si se emplea como formol-cálcico (formol al 10% y cloruro cálcico al 1%). De esta manera los iones de calcio estabilizan los lípidos y el formol los fija más eficazmente.

Orceína

Uno de los tintes más empleados, se utiliza para diferenciar núcleo. Caliente suavemente 45 mL de Acido Acético y agregue 2 g de Orceína, deje enfriar y agregue 55 mL de agua destilada.




Lugol

El lugol o solución de Lugol es una solución de yodo diatómico|I2 (1%) en equilibrio con yoduro de potasio KI (2%) en agua destilada. Fue nombrada en honor al médico francés Jean Guillaume Auguste Lugol.

Este producto se emplea frecuentemente como desinfectante y antiséptico, para cubrir deficiencias de yodo, y para la desinfección de agua en emergencias.  En microbiología, es empleado en la tinción de Gram para retener el colorante cristal violeta. Este reactivo reacciona con algunos polisacáridos como los almidones, glucógeno y ciertas dextrinas, formando un complejo de  color diferente ( negro, azul, verde ) según las ramificaciones que presente la molécula.

El yoduro de potasio es agregado para aumentar la solubilidad del yodo diatómico por formación del anión triatómico I3-.   Además se utiliza como antiséptico y en determinación de algunos polisacáridos, como el almidón o el glucógeno. Frente a la presencia de estos, vira al color negro-morado.




Preparación

                                Yodo                               1 g
                                Agua destilada                 300 mL
                                Yoduro de potasio           2 g

Se mezclan y se filtran.


Amiloplastos teñidos con lugol

Proceso de tinción

Para aplicar el tinte se procede a sacar el tejido del fijador y ponerlo en agua destilada por lo menos 20 minutos, esto se hace para sacar el fijador del tejido, lo cual, de no hacerse puede interferir en el proceso de tinción. En ocasiones se deben hidrolizar las paredes celulares, para realizar esto una vez lavado el tejido y sacado el fijador se aplica HCl 18% durante tres minutos ( también se puede utilizar Acido Acético 45% ) y se lava de nuevo con agua destilada por lo menos en 6 o 7 ocasiones diferentes. Para realizar los lavados se coloca el tejido sobre un portaobjetos y se agregan 2 o 3 gotas de agua destilada con un gotero, se espera por espacio de 2 o 3 minutos y luego se seca con papel filtro o toalla absorbente, el cual absorberá el agua por capilaridad. Una vez lavado el tejido se aplican 1 o 2 gotas de tinte y se macera el tejido. En ocasiones se utiliza una lámpara de alcohol para calentar suavemente el tejido macerado, no se debe dejar que se seque el tinte . Al calentar suavemente el tinte tiene oportunidad de actuar mejor, en caso de que se seque un poco se puede agregar una gota de agua destilada, una vez teñido el tejido se coloca el cubreobjetos y se observa.

Procedimiento: 

Realice diferentes cortes de material vegetal ( longitudinal, transversal y oblicuos ). Aplique a cada muestra una gota de los diferentes tintes. Realice observaciones y dibujos en bajo y mediano poder. Trate de observar el tipo de estructuras y materiales que se logra teñir con cada uno de los tintes.


lunes, 4 de enero de 2010

Inicio del Blog

Allá por 1998 empecé a utilizar la internet como un recurso de apoyo, para mis cursos de Ciencias Básicas  ( Biología General en diversas áreas como Salud y Ciencias Ambientales, hasta cursos de Zoología y Ecología ), primeramente utilizando el servicio de la desaparecida Geocities y luego alojándome en el servidor de las diversas universidades, cuando había que rogar por 25 megas de espacio pues nadie podía entender la proyección de este recurso.  En aquel entonces casi ninguno de mis estudiantes tenía correo o acceso a la Internet, hoy eso ha cambiado completamente.

Con el paso del tiempo seguí utilizando una variedad de herremientas para producir mis materiales en diversos formatos multimedia, desde complejas animaciones en Director y en Flash, que no pude continuar por mis pocos conocimientos en programación, y la utilización de presentaciones en diversas suites de ofimática hasta la utilización del  formato de PDF.  A mis estudiantes hasta les obligué a hacer una página WEB, cuando nadie pensabe en eso, y más recientemente  en la elaboración de un Blog, lo cuañl ha sido una interesante experiencia.  Precisamente hoy me decidí a abrir un Blog en el cual ellos puedan sentir el apoyo a través de los recursos tecnológicos y que a la vez haya una interacción más alla del salón de Clase.